CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E FENOTÍPICA DE AMOSTRAS DE Escherichia coli ENTEROAGREGATIVA (EAEC) E COM PADRÃO CHAIN-LIKE ADHESION (CLA) DE CRIANÇAS COM E SEM DIARRÉIA.

Nome: Mariane Vedovatti Monfardini Sagrillo
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 27/04/2012
Orientador:

Nomeordem decrescente Papel
Liliana Cruz Spano Orientador

Banca:

Nomeordem decrescente Papel
Ana Paula Ferreira Nunes Suplente Interno
Isabel Cristina Affonso Scaletsky Coorientador
Liliana Cruz Spano Orientador
Moises Palaci Examinador Interno
Waldir Pereira Elias Junior Examinador Externo

Resumo: Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é considerada um patógeno emergente de diarreia aguda e persistente em crianças, conhecida pela heterogeneidade de isolados. O objetivo deste estudo foi caracterizar, através de métodos genotípicos e fenotípicos, amostras de E. coli com padrão de aderência agregativo (AA) (n=189) e chain-like adhesion (CLA) (n=13), positivos (n=81) ou negativos (n=108) para plasmídio pAA, de 202 crianças com até doze anos de idade, com (n=57) e sem diarréia (n=145), provenientes de comunidades quilombolas e de bairros de periferia do Norte do Espírito Santo, Brasil. Foram realizados: (i) PCR monoplex e multiplex para detecção de 20 genes de virulência, plasmidiais e/ou cromossômicos (aafA, aap, agg-3A, aggA, aggR, agn43, astA, chuA, fis, hlyA, irp2, iucA, papC, pet, sat, sen, set1A, sfa, shf e yafK) e categorizados qualitativamente conforme a frequência encontrada; (ii) Teste de formação de biofilme em superfície abiótica, em meio mínimo de Eagle modificado por Dulbecco com 0,4% de glicose, corado com safranina e cristal violeta seguido por leitura de densidade ótica para classificação em formador (forte e fraco) e não formador; (iii) Ensaio de formação de película em caldo Mueller Hinton sob agitação a 37ºC por 20 horas, e classificados em score (0, +, ++, +++). Os seguintes genes foram detectados nos isolados com padrão AA: (i) fis e yafK em altíssima frequência (>80% das amostras); (ii) irp2, pet, agn43 e iucA em alta frequência (30-50% das amostras); (iii) astA e shf em moderada frequência (20-30%); (iv) aap, aggR, sat, set1A e chuA em baixa frequência (10-20%) e; (v) aafA, aggA, agg-3A, hlyA, papC e sen em baixíssima frequência (<10%). O gene sfa não foi encontrado. O gene agn43 foi estatisticamente significante entre as amostras de EAEC de crianças com diarreia (p<0,05). EAEC típica e atípica, classificadas conforme a presença do regulador transcripcional AggR, corresponderam a 16,4% e 83,6% do isolados, respectivamente, e não foram associadas à diarreia (p>0,05). Os genes aap e agn43 foram isoladamente associados aos isolados de EAEC atípica de crianças com diarreia (p<0,05). O gene chuA foi associado aos isolados pAA- de crianças com diarreia (p<0,05). Foram produtoras de biofilme 30,7% (safranina) e 24,9% (cristal violeta) das amostras de EAEC e nenhuma com padrão CLA. Os genes aap, agg-3A, aggR e shf foram significantes entre os isolados biofilme+ (p<0,05). A formação de clump foi encontrada em 72% das amostras de EAEC e em 100% das E. coli com padrão CLA. Nas amostras com padrão CLA foram detectados nove dos 20 genes pesquisados [fis (100%), pet (92,3%), iucA (76,9%), yafK (76,9%) agn43 (69,2%), chuA (7,7%), hlyA (15,4%), irp2 (23,1%) e shf (7,7%)]. Estes resultados demonstram (i) a baixa frequência de EAEC típica na população estudada, (ii) genes que codificam as adesinas AAF em baixíssima frequência, (iii) a formação de biofilme incomum nas amostras de EAEC e não associada à diarreia, (iv) E. coli com padrão CLA com características genotípicas e fenotípicas distintas da EAEC. Estes resultados confirmam a heterogeneidade genética dos isolados de EAEC e sugerem subpopulações mais virulentas (EAEC agn43+, EAEC atípica aap+ e/ou agn43+ e, EAEC pAA- chuA+).

Palavras-chave: 1. Escherichia coli enteroagregativa. 2. Escherichia coli com padrão chain-like adhesion. 3. Genes de virulência. 4. Formação de biofilme. 5. Formação de película.

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