Análise de virulência e ação de antimicrobianos terapêuticos e potenciais antimicrobianos em células planctônicas e em biofilme de Escherichia coli enteroagregativa: um estudo in vitro e in vivo

Nome: Caroline Gastaldi Guerrieri Trés
Tipo: Tese de doutorado
Data de publicação: 01/11/2022
Orientador:

Nomeordem decrescente Papel
Liliana Cruz Spano Orientador

Banca:

Nomeordem decrescente Papel
Ana Paula Ferreira Nunes Examinador Interno
André Luis Souza dos Santos Coorientador
Liliana Cruz Spano Orientador
Marcos Dias Pereira Examinador Externo
Marta Helena Branquinha de Sá Examinador Externo
Ricardo Pinto Schuenck Examinador Interno

Resumo: Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) tem como características marcantes a heterogeneidade quanto aos potenciais fatores de virulência e formação de biofilme. Pode ser classificada em típica (tEAEC) e atípica (aEAEC) com base na presença do regulon AggR, sugerindo-se uma maior virulência para tEAEC. Em consequência de sua grande heterogeneidade, sua identificação e determinação do perfil de susceptibilidade não são realizadas na rotina de diagnóstico laboratorial e seu tratamento é feito de forma empírica. Além disso, a formação de biofilme, que leva à ocorrência de infecções persistentes que podem necessitar de terapia antimicrobiana, confere resistência a antimicrobianos e impossibilita sua erradicação. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para infecções por EAEC, principalmente associadas à formação de biofilme, são extremamente necessários. Fendiona e seus derivados metálicos (Ag-fendiona e Cu-fendiona) vêm se mostrando eficazes contra diversos microrganismos, porém até o momento não foi investigada sua atividade em isolados de E. coli. Diante do exposto, tivemos como objetivo analisar in vivo aspectos da virulência de EAEC e analisar in vitro e in vivo a ação de antimicrobianos clássicos e novos (fendiona e seus derivados) sobre células planctônicas e biofilme de EAEC. Em relação às análises de virulência, avaliamos a sobrevivência das larvas após a inoculação da cepa EAEC 042 selvagem e mutante para o regulon AggR. Para avaliação da terapia combinada com antimicrobianos clássicos, o biofilme foi formado em sistema peg-lid, tratado com combinações de antimicrobianos de diferentes classes terapêuticas e determinado o potencial de inibição e erradicação de cada combinação. Analisamos também a atividade dos compostos derivados da fendiona para EAEC na forma planctônica por meio da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e avaliação de combinações dos compostos com antimicrobianos para cepas resistentes, empregando as metodologias de checkerboard e curva tempo-morte. Também investigamos a atividade anti-biofilme dos compostos por meio da determinação da concentração inibitória mínima em biofilme (MBIC) e concentração mínima de erradicação de biofilme (MBEC), além de outros aspectos como a capacidade de inibir a formação e desarticular o biofilme maduro e a possibilidade de utilização dos compostos associados a antimicrobianos clássicos como terapia combinada para inibição e erradicação do biofilme. Por fim, testamos o tratamento com Cu-fendiona e Ag-fendiona e sua associação com ampicilina in vivo em modelo de G. mellonella. Em relação à virulência de EAEC, observamos que a cepa EAEC 042 mutante AggR apresentou redução significativa na mortalidade das larvas inoculadas em relação à cepa selvagem, porém sua virulência não foi completamente perdida. A terapia combinada de antimicrobianos clássicos em biofilme de EAEC levou à erradicação de 50% das cepas testadas (2/4) nas combinações ciprofloxacina-ampicilina e ciprofloxacina-tobramicina. Fendiona e seus complexos metálicos apresentaram alta atividade contra cepas de EAEC na forma planctônica com baixo valor de CIM e, combinando os complexos metálicos com antimicrobianos pelo método checkerboard, observamos efeito aditivo na maioria das combinações. Por outro lado, nos experimentos de curva tempo-morte, os compostos mostraram sinergismo tanto com a tetraciclina quanto com a ampicilina. Em relação a atividade em biofilme, Cu-fendiona apresentou o melhor resultado na inibição e na erradicação do biofilme (68,6% - 24/35 cepas), na desarticulação do biofilme maduro (IC50 = 1,87 μM) e na inibição da formação de biofilme, principalmente com seis horas de incubação. Avaliando a terapia combinada em biofilme, observamos a erradicação do biofilme de todas as cepas (4/4) nas combinações de Cu-fendiona com cefoxitina, tobramicina, tetraciclina e ciprofloxacina, e nas combinações de Ag-fendiona com tobramicina e ciprofloxacina. Além disso, a combinação de ampicilina com Ag-fendiona aumentou significativamente a sobrevivência das larvas de G. mellonella quando comparada à ampicilina administrada individualmente. Em conclusão, os resultados aqui obtidos demonstram que a virulência in vivo de EAEC parece estar relacionada ao regulon AggR, mas não exclusivamente. Em relação as estratégias de tratamento de infecções por EAEC associadas à formação de biofilme, apesar da terapia combinada com dois antimicrobianos clássicos ter apresentado melhores resultados que o tratamento com os antimicrobianos isoladamente, analisados em estudo prévio, os compostos derivados de fendiona se mostraram mais promissores especialmente pela sua capacidade de erradicar o biofilme tanto isoladamente como em associação com antimicrobianos clássicos.

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